1 培養(yǎng)基和試劑

平板計數(shù)瓊脂、75%乙醇、磷酸鹽緩沖稀釋液

2 操作程序

2.1 樣品制備

2.1.1以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內(nèi)。如有包裝，則用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。

2.1.2制備樣品勻液

以無菌操作取25g樣品，放入裝有225ml稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)1-2min，制成1：10的樣品勻液。如樣品均質(zhì)時間超過2min，應(yīng)在均質(zhì)杯外加冰水冷卻。

2.2 稀釋樣品勻液

2.2.1用10ml滅菌吸管準(zhǔn)確吸取1：10的樣品勻液10ml，放入裝有90ml稀釋劑的150ml 稀釋瓶中。迅速振搖，將樣品混勻，制成1：100的樣品勻液。振搖時，幅度為30cm，7s內(nèi)振搖25次。從容器中吸取樣品勻液和以后的稀釋操作中，吸管尖不要碰著瓶口。吸入的液體應(yīng)先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端離開液面并貼在容器內(nèi)壁將液體調(diào)至所要求的刻度。

2.3 平板接種

2.3.1對于每個樣品，選用合適的三個連續(xù)稀釋度的樣品液進行平板計數(shù)。

2.3.2分別用滅菌吸管吸取1ml樣品液放入作了適宜標(biāo)志的平皿內(nèi)。每個稀釋度的樣品液用兩個平皿。

2.3.3分別加12-15ml平板計數(shù)瓊脂(約45℃左右)到平皿內(nèi)。立即將平皿內(nèi)的樣品液和瓊脂培養(yǎng)基充分混合。要防止把混合物濺到平皿壁和蓋上。同時將平板計數(shù)瓊脂傾入加有1ml稀釋劑的另一滅菌平皿作空白對照。將樣品液加入平皿后應(yīng)立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用的時間不得超過20min。

2.4 培養(yǎng)

待瓊脂凝固后將平皿翻轉(zhuǎn)，立即放進36±1℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48±2h。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，經(jīng)48h培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基的失重不得超過15%。

2.5 菌落計數(shù)和記錄

2.5.1培養(yǎng)后，立即計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)。25-250個菌落為合適范圍。如不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板存放于0-4℃，但不得超過24h。

2.5.2操作者對同一平板復(fù)核自己的計數(shù)結(jié)果，其差異應(yīng)在5%之內(nèi)，而其他人對這一平板重復(fù)計數(shù)，其差異應(yīng)在10%這內(nèi)。否則，應(yīng)找出原因，加以校正。

2.6 計算和記錄數(shù)字：適宜稀釋度的兩個平板的菌落數(shù)平均值或兩個稀釋度的平板菌落數(shù)平均值乘以相應(yīng)稀釋度倍數(shù)計算出每克(毫升)樣品中平板菌落數(shù)。

記錄時，只有在換算到每克(毫升)樣品中平板菌落數(shù)時，才能定下兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)字采用四舍五入的方法記錄。也可將樣品的平板菌落數(shù)記錄為10的指數(shù)形式。

3 結(jié)果報告

報告每克(毫升)樣品中平板菌落數(shù)或估計的平板菌落數(shù)。

9.保存細(xì)菌的方法

1、細(xì)菌保存于穿刺培養(yǎng)物中：一般細(xì)菌保存于穿刺培養(yǎng)物可以維持兩年。具體方法：用滅菌接種針挑取分散良好的單菌落，針緩慢穿過瓊脂到達瓶底，連續(xù)幾次，蓋上瓶蓋擰緊，做好標(biāo)記。室溫下存放于暗處。(最好一點可以將瓶蓋放松，在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)過夜，再擰緊瓶蓋并加封Parafilm膜，室溫或最好在4度避光保存)。

2、細(xì)菌保存于含有甘油的培養(yǎng)物中：

(1)在液體培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌培養(yǎng)物：取0.85ml細(xì)菌培養(yǎng)物，加入0.15ml高壓滅菌甘油，振蕩培養(yǎng)物使甘油分布均勻，然后轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的保存管內(nèi)，密封，在乙醇-干冰或液氮中凍結(jié)后再轉(zhuǎn)至-70度長期保存。在復(fù)蘇時，用滅菌接種針刮取凍結(jié)的培養(yǎng)物表面，然后立即把黏附于接種針上的細(xì)菌劃于含適當(dāng)抗生素的LB瓊脂平板表面，于37度過夜。

(2)在瓊脂平板上生長的細(xì)菌培養(yǎng)物：從瓊脂平板表面刮下細(xì)菌放入裝有2mlLB的無菌試管內(nèi)，再加入等量的含有30%滅菌甘油的LB培養(yǎng)基，振蕩使甘油完全分布均勻后，分裝于無菌保存管內(nèi)，密封，再按前述方法冰凍保存。這一方法的優(yōu)點在于可用于保存在質(zhì)粒載體上建立的cDNA文庫。

如果甘油與培養(yǎng)基混合后凍存在一般冰箱的冰凍室里，不能反復(fù)復(fù)蘇使用，而且如果甘油含量太低，凍結(jié)成冰塊，復(fù)蘇效果不佳。一般都使用甘油終濃度為30%。